cuantifique su muestra de ARN midiendo su absorbancia de la luz ultravioleta (uv). un espectrofotómetro de nano-gotas utilizará solo uno o dos microlitros de su muestra, que puede recuperar. otros espectrofotómetros requieren una muestra mucho más grande. el coeficiente de extinción para los nucleótidos a una longitud de onda ultravioleta de 260nm en una trayectoria de luz de 1 cm es 20. basado en este coeficiente de extinción, la absorbancia de 40 µg / ml de rna en las mismas condiciones es uno. Con esta información, puede calcular la concentración de su muestra de ARN.
Haz una dilución, si es necesario, de tu muestra. una dilución estándar para una microcubeta es 1:40. realice esta dilución agregando 2 µl de muestra de rna a 78 µl de agua estéril.
siga los protocolos de su espectrofotómetro particular para calibrar la máquina usando un blanco y luego determine la densidad óptica de su muestra a una longitud de onda UV de 260nm.
multiplique la absorbancia de su muestra por su factor de dilución por 40μg de rna / ml. la ecuación sería: “concentración de rna (µg / ml) = (od260) x (factor de dilución) x (40µg rna / ml) / (1 od260 unidades)” (hofstra.edu) por ejemplo: si diluyó su muestra con 1:40 y su lectura de absorbancia fue de 0.08, usted multiplicaría 0.08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0.13 µg / μl
Calcule la pureza de su muestra tomando otra lectura de absorbancia a una longitud de onda UV de 280 nm. la relación od 260 / od 280 indicará si, y a qué nivel, su muestra está contaminada con proteínas o fenol. un resultado de 1.8 a 2.0 indica la calidad rna.
propina
No olvides calibrar tu espectrofotómetro. ejecutar un gel electroforético rápido confirmará los resultados de sus especificaciones.
advertencia
no asuma que su muestra es pura tomarse el tiempo para una relación od260 / od280 ahorra tiempo y dinero en el camino.