de acuerdo con el sitio web bioweb de la universidad de Wisconsin, un cebador pcr es un oligonucleótido sintético corto (generalmente entre 18 y 25 bases) que se utiliza para amplificar regiones específicas de ADN en una técnica de biología molecular conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCP). Se necesitan tanto un cebador directo como uno inverso, diseñados para ser complementos inversos de la hebra de ADN, para flanquear y unirse a la región de ADN deseada. cuando los científicos desean realizar una investigación sobre un gen específico o una región de ADN, primero deben realizar una PCR para adquirir la región objetivo con la que trabajar. el diseño de secuencias de cebadores para la región de interés puede ser necesario si aún no están disponibles a través de investigaciones publicadas previamente o por medios comerciales.
obtenga la secuencia de nucleótidos del gen o la región de ADN de interés y decida durante cuánto tiempo desea amplificar un fragmento. el cebador directo e inverso está diseñado para unirse al principio y al final del fragmento deseado. por lo general, los métodos de pcr convencionales utilizan cebadores que flanquean una región de entre 100 y 1.000 pares de bases de longitud, mientras que los métodos de pcr en tiempo real utilizan fragmentos de entre 50 y 200 pares de bases de longitud.
decide en qué parte de la secuencia quieres que estén los cebadores. por ejemplo, es posible que desee la ubicación cerca del extremo 5 'o 3' de la secuencia o en el medio. si lo desea, designe la ubicación de los cebadores para abarcar un intrón.
Siga las pautas recomendadas para el diseño de imprimaciones. La amplificación exitosa del producto de ADN depende de la calidad de los cebadores y ciertas variables son críticas.
Los cebadores de diseño deben tener una longitud de 18 a 24 bases. vincent r. Prezioso, ph.d., de Brinkmann Instruments Inc., sugiere que esta longitud es lo suficientemente larga como para ser extremadamente específica a la región de ADN deseada, pero lo suficientemente corta para unirse (recocer) fácilmente. la temperatura de fusión del cebador (tm) debe estar entre 55 y 80 grados centígrados, lo suficientemente baja para permitir la fusión completa a 90 grados centígrados o más, pero lo suficientemente alta como para permitir el recocido. el contenido de gc (porcentaje de gs y cs en la secuencia) debe estar entre 40 y 60 por ciento. el extremo 3 'de la secuencia del cebador debe terminar en ac o ag (llamada pinza gc) para promover la unión, ya que los nucleótidos g y c tienen enlaces más fuertes, sin embargo, evite tener tres o más gs o cs en las últimas cinco bases de la secuencia.
evite tener series de cuatro o más de una base (como acccc ...) o cuatro o más repeticiones de di-nucleótidos (como atatatat ...) porque pueden causar errores de imprenta. diseñar cebadores sin homología intra-cebador (más de tres bases que se complementen dentro del propio cebador) o homología entre cebadores (donde el cebador directo e inverso tienen secuencias complementarias). esto puede causar auto-dímeros o dímeros de cebadores, donde los cebadores se unen a sí mismos en lugar de unirse a la secuencia de ADN deseada.
use recursos en línea y sitios web que ayuden en el diseño de imprimaciones o ayude a verificar las secuencias de las imprimaciones para auto-complementariedad o el potencial para hacer estructuras secundarias como horquillas. algunos sitios web de diseño de imprimadores incluyen Primer3 del instituto de tecnología de Massachusetts, el centro nacional de imprimación de información de biotecnología y el oligoanalizador de tecnologías de ADN integradas.