C贸mo dise帽ar una cartilla de PCR

C贸mo dise帽ar una cartilla de PCR

de acuerdo con el sitio web bioweb de la universidad de Wisconsin, un cebador pcr es un oligonucle贸tido sint茅tico corto (generalmente entre 18 y 25 bases) que se utiliza para amplificar regiones espec铆ficas de ADN en una t茅cnica de biolog铆a molecular conocida como reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCP). Se necesitan tanto un cebador directo como uno inverso, dise帽ados para ser complementos inversos de la hebra de ADN, para flanquear y unirse a la regi贸n de ADN deseada. cuando los cient铆ficos desean realizar una investigaci贸n sobre un gen espec铆fico o una regi贸n de ADN, primero deben realizar una PCR para adquirir la regi贸n objetivo con la que trabajar. el dise帽o de secuencias de cebadores para la regi贸n de inter茅s puede ser necesario si a煤n no est谩n disponibles a trav茅s de investigaciones publicadas previamente o por medios comerciales.

    obtenga la secuencia de nucle贸tidos del gen o la regi贸n de ADN de inter茅s y decida durante cu谩nto tiempo desea amplificar un fragmento. el cebador directo e inverso est谩 dise帽ado para unirse al principio y al final del fragmento deseado. por lo general, los m茅todos de pcr convencionales utilizan cebadores que flanquean una regi贸n de entre 100 y 1.000 pares de bases de longitud, mientras que los m茅todos de pcr en tiempo real utilizan fragmentos de entre 50 y 200 pares de bases de longitud.

    decide en qu茅 parte de la secuencia quieres que est茅n los cebadores. por ejemplo, es posible que desee la ubicaci贸n cerca del extremo 5 'o 3' de la secuencia o en el medio. si lo desea, designe la ubicaci贸n de los cebadores para abarcar un intr贸n.

    Siga las pautas recomendadas para el dise帽o de imprimaciones. La amplificaci贸n exitosa del producto de ADN depende de la calidad de los cebadores y ciertas variables son cr铆ticas.

    Los cebadores de dise帽o deben tener una longitud de 18 a 24 bases. vincent r. Prezioso, ph.d., de Brinkmann Instruments Inc., sugiere que esta longitud es lo suficientemente larga como para ser extremadamente espec铆fica a la regi贸n de ADN deseada, pero lo suficientemente corta para unirse (recocer) f谩cilmente. la temperatura de fusi贸n del cebador (tm) debe estar entre 55 y 80 grados cent铆grados, lo suficientemente baja para permitir la fusi贸n completa a 90 grados cent铆grados o m谩s, pero lo suficientemente alta como para permitir el recocido. el contenido de gc (porcentaje de gs y cs en la secuencia) debe estar entre 40 y 60 por ciento. el extremo 3 'de la secuencia del cebador debe terminar en ac o ag (llamada pinza gc) para promover la uni贸n, ya que los nucle贸tidos g y c tienen enlaces m谩s fuertes, sin embargo, evite tener tres o m谩s gs o cs en las 煤ltimas cinco bases de la secuencia.

    evite tener series de cuatro o m谩s de una base (como acccc ...) o cuatro o m谩s repeticiones de di-nucle贸tidos (como atatatat ...) porque pueden causar errores de imprenta. dise帽ar cebadores sin homolog铆a intra-cebador (m谩s de tres bases que se complementen dentro del propio cebador) o homolog铆a entre cebadores (donde el cebador directo e inverso tienen secuencias complementarias). esto puede causar auto-d铆meros o d铆meros de cebadores, donde los cebadores se unen a s铆 mismos en lugar de unirse a la secuencia de ADN deseada.

    use recursos en l铆nea y sitios web que ayuden en el dise帽o de imprimaciones o ayude a verificar las secuencias de las imprimaciones para auto-complementariedad o el potencial para hacer estructuras secundarias como horquillas. algunos sitios web de dise帽o de imprimadores incluyen Primer3 del instituto de tecnolog铆a de Massachusetts, el centro nacional de imprimaci贸n de informaci贸n de biotecnolog铆a y el oligoanalizador de tecnolog铆as de ADN integradas.



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