La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio de uso común con muchas aplicaciones prácticas que incluyen huellas dactilares de ADN y secuenciación del genoma. El proceso consiste en separar fragmentos de ADN utilizando una corriente eléctrica mientras se rastrea la velocidad del movimiento molecular a través de un gel filtrante.
Agregar un tinte de rastreo azul o naranja a las muestras de ADN incoloras le permite ver su muestra y obtener información sobre cómo se mueven las moléculas de ADN durante la electroforesis. La identificación se basa en el tamaño de las bandas de ADN en el gel después de la migración de las moléculas.
cómo funciona la electroforesis en gel
La electroforesis en gel extrae fragmentos de ADN a través de un gel utilizando una corriente eléctrica para aislar e identificar las moléculas de ADN por tamaño y carga eléctrica. el gel a menudo se hace con polvo de agarosa , un polisacárido extraído de algas marinas .
Se agrega agarosa a una solución tampón de agua y sal, y la mezcla se calienta y enfría para hacer un gel poroso que actuará como una matriz de filtración durante el procedimiento de electroforesis. El gel se coloca en una unidad de electroforesis y se cubre con una solución tampón que conduce la electricidad .
Las soluciones que contienen ADN y colorantes de carga se pipetean en pequeños pocillos en el gel que deben prepararse durante la preparación del gel. los tintes lo ayudan a ver claramente la muestra que está agregando a los pocillos de gel ubicados cerca del electrodo negativo de la unidad de electroforesis.
Un electrodo positivo se encuentra en el extremo opuesto. Se coloca un estándar conocido de fragmentos de ADN en el primer pozo que creará una escalera de bandas de ADN para fines de comparación e identificación.
El esqueleto de fosfato de las moléculas de ADN le da al ADN una carga negativa. los opuestos se atraen, por lo tanto, las moléculas de ADN son atraídas hacia el electrodo positivo y comienzan a moverse, o "migrar", cuando se activa una corriente eléctrica.
Los fragmentos de ADN de menor tamaño viajan más rápido que los fragmentos más grandes porque encuentran menos resistencia a medida que migran a través de la matriz porosa del gel. fragmentos de ADN de tamaño similar forman bandas de ADN en el gel.
propósito e importancia del tinte de carga
El ADN es incoloro, por lo que agregar tintes de seguimiento a una muestra lo ayuda a determinar la velocidad de movimiento de las moléculas de proteínas de diferentes tamaños en el gel durante la electroforesis. Los ejemplos de colorantes de carga que se mueven con la muestra de ADN incluyen azul de bromofenol y xilen cianol.
El tinte elegido no debe ser reactivo ni alterar el ADN. El azul de bromofenol es un colorante utilizado para rastrear hebras de ADN de menor tamaño que contienen aproximadamente 400 pares de bases, mientras que el xilen cianol es mejor para hebras de ADN más grandes con hasta 8,000 pares de bases. El tinte elegido no debe ser reactivo ni alterar el ADN.
papel del glicerol en la electroforesis en gel de agarosa
al preparar su muestra de ADN para electroforesis , deberá agregar glicerol y agua junto con los tintes de carga. El glicerol es una sustancia espesa y almibarada que le da más densidad a la muestra de ADN antes de insertarla en los pocillos en un extremo de la lámina de gel.
sin glicerol, la muestra de ADN se dispersaría en lugar de hundirse y formar una capa en el pozo, como se supone que debe hacer para formar una escalera de ADN.
tinte de seguimiento en la página sds
La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (página sds) es una técnica adecuada para separar proteínas y aminoácidos, que son más pequeños y más complejos que las moléculas de ADN lineales. Se utiliza poliacrilamida (gel de página sds) en lugar de gel de agarosa para electroforesis.
El azul de bromofenol (bpb) se agrega al tampón de muestra como un tinte de seguimiento que se mueve en la misma dirección de separación de proteínas y demarca su borde de ataque.
papel del tinte de unión al ADN
Se puede añadir al gel o al tampón de electroforesis un tinte de unión a ADN tal como bromuro de etidio de color naranja . Como su nombre indica, el tinte se adhiere a la molécula de ADN.
Se debe tener mucho cuidado al manipular este tinte mutagénico porque puede unirse al ADN en las células de la piel. A diferencia de los tintes de rastreo, el bromuro de etidio fluoresce intensamente bajo la luz ultravioleta , haciendo visibles las bandas de ADN.