Las desventajas de Western Blotting

Western Blot es uno de los procedimientos más comunes en los laboratorios bioquímicos. Básicamente, separa las proteínas de una muestra por tamaño, luego las pruebas usan anticuerpos para determinar si una proteína dada está presente. Es útil no solo en investigación sino también en laboratorios médicos o de diagnóstico; las pruebas para el vih y la enfermedad de Lyme, por ejemplo, involucran una prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (elisa), seguida de un western blot si el elisa da positivo. A pesar de su popularidad, sin embargo, el Western Blot tiene varias desventajas.

Las transferencias de western clásicas no son cuantitativas. en otras palabras, aunque pueden decirle a los investigadores si una proteína en particular está presente, no permiten cuantificar qué cantidad de proteína está presente. algunas empresas de biotecnología ahora venden kits que permiten a los investigadores o técnicos de laboratorio cuantificar la cantidad de proteína presente utilizando una curva estándar, pero esto solo funciona si hay disponibles muestras puras de la misma proteína. además, el peso molecular de una proteína solo se puede estimar con Western blot, en lugar de determinarse con precisión como con la espectrometría de masas.

una transferencia Western solo se puede realizar si se dispone de anticuerpos primarios contra la proteína de interés. Si bien los anticuerpos contra muchas proteínas diferentes están disponibles en las compañías de biotecnología, no son baratos; Si los anticuerpos primarios no están disponibles para una proteína dada, no será posible realizar una transferencia Western en busca de esa proteína en particular. además, los investigadores pueden querer determinar si una proteína ha sido modificada de alguna manera, si ha sido fosforilada (tenía un grupo fosfato unido a ella), por ejemplo, y con la técnica Western Blot necesitan anticuerpos específicos para la proteína modificada. proteína.

Puede ser un desafío realizar un Western Blot correctamente y obtener buenos resultados, por lo que el personal debe estar bien capacitado. en esto como en muchas otras cosas, la experiencia es quizás el mejor tutor; Sin embargo, incluso para un técnico experimentado, una transferencia Western requiere mucho tiempo. La porción de electroforesis en gel del experimento, por ejemplo, normalmente demorará entre una y dos horas en ejecutarse. Por supuesto, se pueden realizar otras tareas mientras se está ejecutando el gel, pero el experimento aún toma bastante tiempo para obtener resultados.

los anticuerpos a veces pueden mostrar alguna unión fuera del objetivo, lo que puede dar lugar a resultados más pobres. además, con la transferencia de western, usa un anticuerpo contra una proteína específica, por lo que sus resultados solo le dirán si esa proteína estaba presente. Por el contrario, la espectrometría de masas de alta resolución revela todas las proteínas presentes en una muestra y, a diferencia de la transferencia Western clásica, es cuantitativa. es importante recordar, por supuesto, que la espectrometría de masas es mucho más costosa y también más difícil de usar técnicamente en comparación con la transferencia Western.