Western Blot, una técnica analítica utilizada para identificar una proteína específica en una muestra dada, emplea la capacidad de una enzima o anticuerpo primario marcado con fluorescencia para unirse a su antígeno específico. Es un proceso de tres pasos que comienza con electroforesis en gel, seguido de transferencia de membrana y sondeo con anticuerpos. la detección de proteínas puede ser directa o indirecta, utilizando este último un anticuerpo secundario marcado dirigido contra el primario. Aunque se acepta como una técnica de análisis de proteínas de rutina, el Western blot tiene tanto limitaciones como beneficios.
ventaja: sensibilidad
Uno de los mayores argumentos a favor de Western Blot es su sensibilidad. Debido a su capacidad para detectar tan solo 0.1 nanogramos de proteína en una muestra, la técnica puede servir teóricamente como una herramienta de diagnóstico temprano eficaz, detectando incluso la respuesta inmunogénica más leve de un virus o bacteria en una muestra de paciente. una transferencia Western indirecta se basa en esta sensibilidad a partir de la capacidad del anticuerpo secundario para amplificar la intensidad de la señal detectada por el sistema de imágenes. una mayor sensibilidad significa que se necesitan menos anticuerpos para las pruebas, lo que reduce significativamente los costos de laboratorio.
ventaja: especificidad
La técnica de Western Blot debe su especificidad a dos grandes factores contribuyentes. Primero, la electroforesis en gel clasifica una muestra en proteínas de diferente tamaño, carga y conformación. este proceso en sí mismo es un gran paso hacia la detección, ya que las bandas formadas en el gel ya dan pistas sobre el tamaño de la proteína o polipéptido de interés. La especificidad de la interacción anticuerpo-antígeno sirve como el segundo gran factor. Debido a que los anticuerpos específicos muestran afinidad por proteínas específicas, el proceso puede detectar selectivamente una proteína objetivo incluso en una mezcla de 300,000 proteínas diferentes.
Desventaja: propenso a resultados falsos o subjetivos.
a pesar de su sensibilidad y especificidad, un western blot todavía puede producir resultados erróneos. un resultado falso positivo cuando un anticuerpo reacciona con una proteína no intencionada, que es lo que sucede con frecuencia cuando un paciente que se realiza una prueba de detección del VIH tiene tuberculosis o una serie de infecciones parasitarias. un falso negativo, por otro lado, puede resultar fácilmente si las proteínas más grandes no tienen suficiente tiempo para transferirse adecuadamente a la membrana. la transferencia y el procesamiento incorrectos a menudo producen bandas sesgadas, descoloridas o incluso múltiples, lo que hace que los resultados de las pruebas estén sujetos a la interpretación del técnico.
Desventaja: alto coste y demanda técnica.
El costo de un Western Blot es un compuesto de los grandes gastos individuales para anticuerpos marcados, analistas expertos y equipo de laboratorio. un proceso delicado, la transferencia Western requiere precisión en cada paso para la identificación adecuada de los constituyentes de una muestra. un error menor en la concentración de reactivo o en el período de incubación puede ser desastroso para todo el proceso. Por último, el equipo requerido para la detección y la obtención de imágenes (quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivos o sistemas de detección por láser) puede ser demasiado costoso para la unidad de microbiología promedio.